IPTG (isopropil-β-D-tiogalattoside) hè un analogu di u substratu di β-galattosidasi, chì hè assai inducibile. Sottu à l'induzione di IPTG, l'induttore pò furmà un cumplessu cù a proteina repressore, in modu chì a cunfurmazione di a proteina repressore hè cambiata, in modu chì ùn pò micca esse cumminata cù u genu bersagliu, è u genu bersagliu hè espressu in modu efficiente. Allora, cumu si deve determinà a cuncentrazione di IPTG durante l'esperimentu? Più grande hè u megliu?
Prima, capimu u principiu di l'induzione IPTG: l'operone (elementu) di lattosiu di E. coli cuntene trè geni strutturali, Z, Y è A, chì codificanu rispettivamente a β-galactosidasi, a permeasi è l'acetiltransferasi. lacZ idrolizza u lattosiu in glucosiu è galattosiu, o in allo-lattosiu; lacY permette à u lattosiu in l'ambiente di passà per a membrana cellulare è entre in a cellula; lacA trasferisce u gruppu acetilu da l'acetil-CoA à u β-galattoside, ciò chì implica a rimozione di l'effettu tossicu. Inoltre, ci hè una sequenza operativa O, una sequenza iniziale P è un genu regulatoriu I. U codice di u genu I hè una proteina repressore chì pò ligà si à a pusizione O di a sequenza di l'operatore, in modu chì l'operone (meta) sia repressu è disattivatu. Ci hè ancu un situ di ligame per a proteina attivatrice di u genu catabolicu - u situ di ligame CAP à monte di a sequenza iniziale P. A sequenza P, a sequenza O è u situ di ligame CAP inseme custituiscenu a regione regulatoria di l'operone lac. I geni codificanti di i trè enzimi sò regulati da a listessa regione regulatoria per ottene l'espressione coordinata di i prudutti genichi.
In assenza di lattosiu, l'operone lac (meta) hè in un statu di ripressione. In questu mumentu, u repressore lac espressu da a sequenza I sottu u cuntrollu di a sequenza di u promotore PI si lega à a sequenza O, chì impedisce à l'ARN polimerasi di ligà si à a sequenza P è inibisce l'iniziu di a trascrizione; quandu u lattosiu hè presente, l'operone lac (meta) pò esse induttu. In questu sistema di operone (meta), u veru induttore ùn hè micca u lattosiu stessu. U lattosiu entra in a cellula è hè catalizatu da a β-galattosidasi per esse cunvertitu in allolattosiu. Quest'ultima, cum'è molecula induttore, si lega à a proteina repressore è cambia a cunfurmazione di a proteina, ciò chì porta à a dissociazione di a proteina repressore da a sequenza O è a trascrizione. L'isopropiltiogalattoside (IPTG) hà u listessu effettu cum'è l'allolattosiu. Hè un induttore assai putente, chì ùn hè micca metabolizatu da i batteri è hè assai stabile, dunque hè largamente utilizatu in i laboratori.
Cumu determinà a cuncentrazione ottima di IPTG ? Pigliate E. coli cum'è esempiu.
A ceppa geneticamente mudificata di E. coli BL21 chì cuntene u pGEX ricombinante pusitivu (CGRP/msCT) hè stata inoculata in un mezu liquidu LB chì cuntene 50 μg·mL-1 Amp, è cultivata durante a notte à 37 ° C. A cultura sopra hè stata inoculata in 10 buttiglie di 50 mL di mezu liquidu LB frescu chì cuntene 50 μg·mL-1 Amp à un rapportu di 1: 100 per a cultura d'espansione, è quandu u valore OD600 era 0,6 ~ 0,8, IPTG hè statu aghjuntu à a cuncentrazione finale. Hè 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Dopu l'induzione à a listessa temperatura è à u listessu tempu, 1 mL di a suluzione batterica hè stata prelevata, è e cellule batteriche sò state raccolte per centrifugazione è sottumesse à SDS-PAGE per analizà l'influenza di diverse concentrazioni di IPTG nantu à l'espressione di e proteine, è dopu selezziunà a concentrazione di IPTG cù a più grande espressione di proteine.
Dopu à l'esperimenti, si scoprirà chì a cuncentrazione di IPTG ùn hè micca a più grande pussibule. Questu hè perchè l'IPTG hà una certa tossicità per i batteri. Superà a cuncentrazione ucciderà ancu a cellula; è in generale, speremu chì più proteine solubili sò espresse in a cellula, megliu hè, ma in parechji casi quandu a cuncentrazione di IPTG hè troppu alta, si formerà una grande quantità d'inclusioni. In u corpu, ma a quantità di proteine solubili diminuisce. Dunque, a cuncentrazione di IPTG più adatta ùn hè spessu micca più grande megliu hè, ma più bassa hè a cuncentrazione.
U scopu di l'induzione è di a cultura di ceppi geneticamente mudificati hè di aumentà u rendimentu di a proteina bersagliu è di riduce i costi. L'espressione di u genu bersagliu ùn hè micca solu influenzata da i fattori propri di u ceppu è da u plasmide d'espressione, ma ancu da altre cundizioni esterne, cum'è a cuncentrazione di l'induttore, a temperatura d'induzione è u tempu d'induzione. Dunque, in generale, prima chì una proteina scunnisciuta sia espressa è purificata, hè megliu studià u tempu d'induzione, a temperatura è a cuncentrazione di IPTG per selezziunà e cundizioni adatte è ottene i migliori risultati sperimentali.
Data di publicazione: 31 dicembre 2021